Sirtuine spalten NAD+‐abhängig Acylreste von Lysinen in Proteinen ab. Eine Fehlregulation von humanem Sirt2 wurde mit der Entstehung von Krebs, entzündlichen und neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht, was es zu einem vielversprechenden Zielprotein für die Wirkstoffforschung macht. Hier präsentieren wir die Entwicklung der ersten Sirt2‐selektiven Affinitätssonde auf Basis einer Kristallstruktur von Sirt2 in Komplex mit einem optimierten Hemmstoff aus der Klasse der SirReals (“Sirtuin Rearranging Ligands”). Dieser zeigt verbesserte Wirkpotenz, Wasserlöslichkeit und zelluläre Wirksamkeit. Die langsame Dissoziation des Enzym‐Sonden‐Komplexes ermöglicht die Erschließung neuer Anwendungsgebiete für die SirReals, darunter biophysikalische Charakterisierungsmethoden, fragmentbasiertes Wirkstoffscreening und Pull‐Down‐Experimente. Dies macht unsere SirReal‐Sonde zu einem wertvollen Werkzeug für weiterführende Studien in der Sirtuin‐Biologie.