DNA‐bindende Proteine erlauben die sequenzspezifische Modifikation von DNA‐basierten Nanostrukturen. Hier untersuchen wir die Eignung von Relaxaseproteinen – speziell TrwC, TraI und MobA – für die Nanofabrikation. Relaxasen sind Komponenten des bakteriellen Konjugationsmechanismus, bei dem Plasmide zwischen Bakterien ausgetauscht werden, wobei sie an DNA durch eine kovalente Phosphotyrosinbindung binden. Wir untersuchen die Anbindung der Relaxasen an zwei prototypische DNA‐Origamistrukturen – stabförmige Sechs‐Helix‐Bündel und flache rechteckige Origami‐Platten. Die Proteine zeigen orthogonale Anbindungseigenschaften mit Ausbeuten von 40–50 % pro Bindestelle, vergleichbar mit alternativen Funktionalisierungsmethoden. Die Ausbeuten variieren zwischen den Origamistrukturen und hängen auch von der Position der Bindestellen ab. Aufgrund ihrer Spezifität für einzelsträngige Zielsequenzen und ihrer orthogonalen Anbindeeigenschaften sind Relaxasen eine einzigartige Erweiterung des molekularen Werkzeugkastens für die Modifikation von DNA‐Nanostrukturen.