Background: The comet assay has become an interesting and a very useful tool for the analysis of the induction and amount of DNA damage in single cells thus offering the opportunity to measure the effectiveness of DNA repair. On the basis of the stling and Johanson protocol we have developed a modified method with increased sensitivity and high reproducibility. Material and Methods: Human tumor cells or isolated human peripheral blood lymphocytes were analyzed in the experiments. The amount of DNA damage and the effectiveness of DNA repair was measured after X-irradiation using the comet assay technique. Results: In this presentation the influences of different methodological factors like agarose concentration, buffer pH, electrophoresis time, electric field strength on the applicability of the comet assay are described in detail and optimum conditions for comet assay experiments have been evaluated. Additionally the authors will show a comparison of different fluorescent DNA dyes pointing out their advantages or disadvantages for comet analysis. The usefulness of this technique and its capabilities are exemplified by showing DNA repair kinetics of human lymphocytes of different healthy or radiosensitive donors after in-vitro irradiation with 2 Gy X-rays. Conclusions: This paper presents data on the optimization and standardization of the original comet assay leading to an extremely fast and practicable protocol in the field of single cell gel electrophoresis. After irradiation with 0.1 Gy an increase in the amount of DNA damage can be measured with high statistical significance and the DNA repair capacitiy of individual cells after X-ray doses of 2 Gy can be analyzed with high reproducibility. The results comparing DNA repair capacities of different donors point out that the comet assay may have the potential for the estimation of individual radiosensitivity.
Hintergrund: Der Comet Assay hat sich in Hinsicht auf die Analyse eines induzierten DNS-Schadens in Einzelzellen zu einer interessanten Technik entwickelt. Zudem wird die Mglichkeit geboten, die Effektivitt der DNS-Reparatur zu messen. Basierend auf dem stling-und-Johanson-Protokoll, haben wir einen modifizierten Comet Assay mit sehr hoher Empfindlichkeit und guter Reproduzierbarkeit entwickelt. Material und Methoden: Humane Tumorzellen oder isolierte menschliche Lymphozyten wurden in den Experimenten untersucht. Der DNS-Schaden und die Effektivitt der DNS-Reparatur nach Rntgenbestrahlung wurden mit Hilfe des Comet Assay, bestimmt. Ergebnisse: Die Einflsse unterschiedlicher methodischer Faktoren wie Agarosekonzentration, pH-Werte der Pufferlsungen, Elektrophoresezeit, Strke des elektrischen Feldes auf die Anwendung des Comet Assay werden zusammengefat und detailliert beschrieben. Zustzlich zeigen die Autoren einen Vergleich unterschiedlicher fluoreszierender DNS-Farbstoffe hinsichtlich ihrer Vor- und Nachteile fr die Analyse der Kometen. Die Anwendbarkeit dieser Technik wird verdeutlicht durch die Darstellung der DNS-Reparaturkinetik menschlicher Lymphozyten unterschiedlicher gesunder und strahlenempfindlicher Spender nach einer In-vitro-Bestrahlung mit 2-Gy-Rntgenstrahlen. Schlufolgerungen: Mit den hier prsentierten Daten soll die Optimierung und Standardisierung des originalen Comet Assay-Protokolls gezeigt werden. Mit dieser extrem schnellen und praktikablen Version der Einzelzell-Gelelektrophorese sind DNS-Schden nach Rntgenbestrahlung mit 0,1 Gy und DNS-Reparaturuntersuchungen nach 2 Gy mebar mit hoher Reproduzierbarkeit. Vergleichende Untersuchungen von DNS-Reparaturkapazitten unterschiedlicher Spender deuten an, da der Comet Assay eine Einschtzung der individuellen Strahlenempfindlichkeit ermglichen knnte.