The only experimental data available on the membrane topology of transition metal ATPases are from in vitro studies on two distinct P-type ATPases (CadA and CopA) of a gastric bacterium, Helicobacter pylori, both postulated to contain eight transmembrane domains (H1 to H8). In this study, H. pylori CadA ATPase was subjected to analysis of membrane topology in vivo by expression of ATPase-alkaline phosphatase (AP) hybrid proteins in Escherichia coli using a novel vector, pBADphoA. This vector contains an inducible arabinose promoter and unique restriction sites for fusion of DNA fragments to phoA. The phoA gene lacking sequences encoding its N-terminal signal peptide was linked to the C-terminal regions of the postulated five cytoplasmic and four periplasmic segments of the H. pylori pump. The results obtained by heterologous expression of ATPase-AP hybrid proteins showed consistence with a model of eight transmembrane domains. They also demonstrated that the H. pylori ATPase sequences are well assembled in the cytoplasmic membrane of E. coli, a neutralophilic bacterium. Cloning and amino acid sequence analysis of the homologous ATPase of Helicobacter felis further verified the topological model for the H. pylori pump analyzed here, although the degree of amino acid sequence identity varied between the corresponding transmembrane segments, from 25% for H1 up to 100% for H6. It was found that the topology of ATPase follows the `positive inside rule'. With respect to the bioenergetic capacities of H. pylori, we discuss here the membrane potential as a possible factor directing insertion of ATPases in the cytoplasmic membrane of gastric bacteria.
Determination de la topologie membranaire de l'ATPase de type P homologue a CadA deHelicobacter pylori par l'expression dans Escherichia coli de fusions avec phoA, et par la regle des charges positives internes. Les seules evidences experimentales de la topologie membranaire des ATPases a metal de transition reposent sur l'etude in vitro de deux ATPases de type P de la bacterie gastrique Helicobacter pylori. On a propose que CadA et CopA contiennent huit domaines transmembranaires (H1 a H8). La topologie membranaire de CadA a ete etudiee ici in vivo. Des proteines hybrides ATPase-phosphatase alcaline (AP) ont ete exprimees dans Escherichia coli a l'aide d'un nouveau vecteur, pBADphoA. Ce vecteur contient un promoteur induit par l'arabinose et des sites de restriction uniques permettant la fusion de fragments d'ADN a phoA. Le gene phoA, depourvu de la region codant le peptide signal, a ete attache a l'extremite C-terminale des 5 segments cytoplasmiques et de 4 segments periplasmiques postules de CadA. Les resultats obtenus par l'expression heterologue des proteines hybrides ATPase-AP sont compatibles avec une topologie a huit domaines transmembranaires. Ils montrent aussi que cette ATPase de H. pylori s'integre correctement dans la membrane cytoplasmique deE. coli, une bacterie neutrophile. Le clonage et l'analyse de la sequence de l'ATPase homologue deHelicobacter felis confirme le modele topologique de la pompe de H. pylori, bien que le degre de conservation des domaines transmembranaires correspondant varie entre 25<space>% (H1) et 100<space>% (H6). La topologie de l'ATPase obeit a la regle positif interne . Compte tenu des capacites bioenergetiques de H. pylori, nous discutons la possibilite que le potentiel de membrane contribue a diriger l'insertion des ATPases dans la membrane cytoplasmique des bacteries gastriques.