Antisense oligonucleotides are currently used for the specific control of the expression of a selected gene. Their putative targets are located in the cytoplasm (messenger RNA) or the nucleus (pre-messenger RNA or DNA). This approach is conditioned by the presence of the antisense molecule inside the cell at sufficient concentrations and in the appropriate compartments. We propose in this paper a simple method for the study of the cytosolic content of internalized oligonucleotides. This method is based on the selective permeabilization of the plasmic membrane by the detergent digitonin. By complexing to membrane cholesterol, the detergent creates pores through which soluble and diffusible species can escape outside the cell. The selectivity of membrane permeabilization was controlled by using compartment markers: lactate dehydrogenase (LDH) for cytosol, dextrane-rhodamine (DEX) and hexosaminidase (HAM) for endocytic vesicles and lysosomes, respectively. Optimal digitonin concentrations and incubation times have been defined to reach the following pattern of membrane permeabilization: LDH > 80%; DEX and HAM < 15%. The method was applied to monitor the quantity of extractible oligonucleotides from cells after endocytosis. The results showed that phosphodiester and phosphorothioate oligomers are readily available in the cytosol (60-50% of the internalized species), whereas those bearing a hydrophobic moiety (fluorescein, cholesterol) are less diffusible probably owing to membrane binding. Internalization and cytosol partition were found to depend on the chemical nature of the oligonucleotide, and also on the sequence and the cell type. This method could be useful for the selection of antisense molecules that exhibit the best internalization and distribution in cells, and for a more appropriate choice of control sequences in antisense studies.Les oligonucleotides sont couramment utilises pour le controle specifique d'un gene choisi soit au niveau de l'ARN messager soit au niveau de l'ARN pre-messager ou de l'ADN, ces deux dernieres entites etant localisees dans le noyau. Ces approches sont conditionnees par la presence en quantites suffisantes de l'oligonucleotide dans les compartiments appropries, le cytosol et le noyau. Nous proposons dans cet article une methode simple pour etudier le contenu cytosolique des oligonucleotides internalises. Cette methode est basee sur une permeabilisation selective de la membrane plasmique par un detergent doux, la digitonine. Les pores crees dans la membrane par le detergent permettent la fuite des especes solubles et diffusibles presentes dans les cellules vers le milieu exterieur. Des marqueurs cytosoliques (lactate deshydrogenase) et de vesicules internes (dextrane-rhodamine pour les endosomes et hexosaminidase pour les lysosomes) sont utilises pour controler le taux de permeabilisation des membranes correspondantes par la digitonine. Des exemples sont presentes sur deux systemes cellulaires avec des oligonucleotides de sequences et de compositions chimiques differentes. Les resultats montrent que l'internalisation et la disponibilite de l'oligonucleotide dans le cytosol sont des parametres qui sont fortement dependants du systeme cellulaire etudie et de la nature chimique de l'oligomere. La mesure de ces parametres peut fournir des donnees importantes pour comparer le comportement des oligonucleotides de sequence et de nature chimique differentes (antisens versus controles ) sur un systeme cellulaire donne et contribuer utilement a l'interpretation des effets biologiques observes.