This study presents a revised method for the extraction of mitochondrial genome (mtDNA) from crayfish species of aquacultural interest, Pacifastacus leniusculus. The mean size of the mitochondrial genome is approximately 18 000 bp. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis performed on the mtDNA has revealed extensive genetic variability within this species. The estimated percentage of nucleotide sequence divergence among the four haplotypes found for P. leniusculus ranges from 1.16 to 3.99%. These data suggest that RFLP analysis of mtDNA may provide greater resolution than protein electrophoresis for population identification among signal crayfish populations. This marker offers new avenues for aquaculture and for understanding the genetic structure and evolutionary history of crayfish populations.Une metode d'extraction de l'ADN mitochondrial (ADNmt) d'une espece d'ecrevisse utilisee en aquaculture, Pacifastacus leniusculus, a ete mise au point. La taille de l'ADNmt est classique, d'environ 18 kb. L'analyse du polymorphisme de restriction a revele une forte variabilite intraspecifique. Le pourcentage de divergence nucleotidique estime entre les quatre haplotypes est compris entre 1,16 et 3,99 %. Ces donnees suggerent que l'analyse par RFLP peut avoir une plus grande resolution que l'electrophorese enzymatique dans l'identification des populations de l'ecrevisse signal. Ce marqueur offre de nouvelles perspectives dans le domaine de l'aquaculture ainsi que pour la comprehension de la structure genetique et de la biologie evolutive des populations d'ecrevisse.